不同前处理方法对饲草中黄曲霉毒素B1测定的影响

关键字：饲草；黄曲霉毒素B₁；ELISA；测定

黄曲霉毒素B₁（简称AFB₁）是黄曲霉菌、寄生曲霉菌产生的次级代谢产物，是目前发现毒性最强的真菌毒素，主要污染玉米、花生、大豆及稻草等^[1]。奶牛摄入被AFB₁污染的饲料后，很少一部分被瘤胃微生物代谢，大部分通过被动扩散进入消化道，在肝脏羟基化形成黄曲霉毒素M₁（简称AFM₁）。残留在乳中的AFM₁也是一种强致癌物质^[2]。目前几乎所有的国家和地区都规定了食品和饲料中AFB₁的最大允许量，国内规定奶牛精料补充料AFB₁的上限为10 μg/kg^[3]。

控制好秸秆类粗饲料中AFB₁的含量可以从源头上杜绝牛奶中AFM₁超标的现象。酶联免疫法（ELISA）因灵敏度高、速度快等优点^[4，5]常作为AFB₁的首选分析方法，但样品基质中的干扰因子（色素、PH等）常造成结果的假阳性^[6，7]。为此本试验采用羊草、苜蓿、饲化秸秆为样品，以加标回收率为指标，比较了液-液萃取、直接提取及亲和层析三种前处理方法的准确性，以确定饲草样品前处理的最佳方法。

1、材料与方法

1.1  样品

     苜蓿、羊草、青贮秸秆与饲化秸秆类3个批次10份样，南京周公草科技发展有限公司；

1.2  试剂

黄曲霉毒素B₁酶免试剂盒，江苏省苏微微生物研究有限公司生产；甲醇（分析纯）；三氯甲烷；样品稀释液：含20%甲醇的PBS溶液；AFB免疫亲和柱 中检维康。

1.3 仪器

     酶标仪MK3 美国热电；振荡器 德国IKA；恒温培养箱 上海跃进医疗；氮吹仪 杭州奥盛仪器；离心机 ；植物粉碎机 ；高效液相荧光色谱仪LC-20A（含RF-10AxL荧光检测器） 日本岛津。

1.4 样品处理方法

1.4.1直接提取：称取粉碎均匀的粗饲料5.0g于50mL具塞离心管中，准确加入25mL50%甲醇水溶液，振荡15min，4000r/min，离心10min,取上清液,样品稀释液稀释不同倍数后，待测。

1.4.2液液萃取：称取粉碎均匀的粗饲料5.0g于100mL具塞三角瓶中，准确加入50mL50%甲醇水溶液，振荡15min，4000r/min，离心10min。准确吸取上清液10mL于125mL分液漏斗中，加入20mL三氯甲烷，加塞轻轻振摇3min，静置分层。放出下层，经盛有约5g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的快速定性滤纸过滤于100mL蒸发皿中，最后用少量三滤甲烷洗涤过滤器，一并收集于试管中，氮气吹干，4mL甲醇溶解PBS缓冲液定容于20mL,待测。

1.4.3亲和层析：称取粉碎均匀的粗饲料25g于250mL具塞三角瓶中，准确加入100mL80%甲醇水溶液，振荡15min，过滤,取上清液10mL、蒸馏水40mL混匀,取10mL混匀液以1-2滴/秒流速过亲和柱，10mL蒸馏水同流速洗柱，再以1mL色谱纯甲醇同流速洗脱，样品稀释液稀释后待测。

1.5 测定方法

1.5.1酶联免疫测定：参照GB/T 17480-2008测定步骤^[8]。

1.5.2高效液相测定：参照GB/T 18979-2003测定方法^[9]略作改动。取1.4.3甲醇洗脱液250µL，氮气挥干，加入1mL正己烷及0.5mL三氟乙酸，混匀1min，室温下放置10min，氮气吹干，85%乙腈水重新溶解，混匀30s，经0.45µm滤膜，供液相测定。色谱条件：流动相，甲醇:乙腈:水=1:3:6,流速0.8mL/min，检测波长365nm，激发波长425nm,柱温40℃,进样20µL。

1.5.3不同稀释倍数的测定（研究稀释倍数对测定值的影响）

取苜蓿、羊草、青贮秸秆及饲化秸秆分别按照1.3.1方法进行提取，用样品稀释液稀释2、4、6、8倍后，以1.5.1方法测定。

1.5.4加标回收测定

平行称取粗饲料样品4份，1份空白，另3份分别添加浓度为50ug/L的AFB₁标准溶液，配制成10、20、40ug/kg的浓度，分别按照1.4所述方法来进行提取，以1.5.1方法测定。

1.5.5 液-液萃取重复性

取同一份饲草样品，平行称取共计8份，按照1.4.2方法来进行提取，以1.5.1方法测定，计算RSD值。

1.5.6液-液萃取ELISA，免疫亲和-ELISA与免疫亲和-HPLC测定比较

取苜蓿、羊草、青贮秸秆及饲化秸秆按照1.4.2方法进行提取，用样品稀释液稀释2倍后，按1.5.1方法测定。同时取相同样本进行1.4.3方法进行提取，按1.5.1与1.5.2分别测定。

2、结果与分析

2.1稀释倍数对测定值的影响

从图1结果可以看出，采用直接提取方法，测定羊草、苜蓿或者饲化秸秆时，随着稀释倍数的扩大，测定值从高到低并趋于稳定。推其原因可能是提取液中存在样品基质的干扰，造成开始测定数值的偏高，但是随着稀释倍数的增加，干扰因子的作用逐渐减弱，因而测定值趋于稳定。

图1 直接提取-不同稀释倍数对测定值的影响

2.2加标回收测定

图2不同样品三种提取方法平均回收率

从图2结果可以发现，秸秆、羊草或苜蓿采用直接提取时，平均回收率均大于105%，甚至达到130%，结果呈一定的假阳性；而采用液-液萃取的方法后，平均回收率在70%~102%之间，回收测定较为稳定；采用亲和层析净化后，平均回收率均小于60%，结果偏阴性。这说明饲化秸秆、羊草或苜蓿直接提取测定存在干扰，与图1的结论相同。由于样品中AFB₁的真实浓度无法得知，所以采用提取后直接稀释一定的倍数测定误差较大。研究发现在提取苜蓿样品时，50%甲醇提取AFB₁时效果不理想，改用甲醇:乙腈:水=3:2:5（体积比）后，平均回收率达85%以上，效果比较满意。

2.3液-液萃取重复性

由表1中的数据可以发现液-液萃取重复性较好，RSD均小于10%。

表1 不同样品液-液萃取重复性测定

2.4液-液萃取-ELISA，亲和层析-ELISA与亲和层析-HPLC测定比较

从表2可知，液-液萃取-ELISA的测定值较亲和层析-ELISA测定值要高，而亲和层析-ELISA与亲和层析-HPLC的测定结果基本一致（前者小于1，后者未检出）。在比较了AFB₁分别在甲醇水的溶液体系与饲草提取液溶液体系，以亲和层析净化后，检测发现回收率后者仅为前者的70%，提示净化后损失较大，主要原因是亲和层析处理样品溶液时，存在洗脱不完全的问题，测定值偏低。研究同时发现，在亲和层析净化时，当AFB₁进样量小于20ng时，由于柱填料非特异性吸附的影响，回收率＜50%。表2中，液-液萃取-ELISA测定结果发现，饲化秸秆中AFB₁含量为8.1μg/kg，经样品处理稀释及亲和柱回收的影响，液相检测衍生前的浓度约为2.0ng/mL，依然高于液相的灵敏度（1.0ng/mL），但是免疫亲和层析-HPLC均未检出，表明亲和层析化损失较大。

表2 不同方法处理后样品AFB₁测定结果         单位：µg/kg

注：“-”为未检出

3、结论

1、直接提取结果偏高主要因素有：饲草青贮的过程中为了防止再次霉变，多用化学熏蒸^[10]，或使用氨化后微生物发酵等方法处理，致使色素、pH、化学残留物等因素对测定的干扰。再因饲草密度轻，吸水性是不可避免的问题，导致提取液的实际浓度偏高，结果呈现一定的假阳性。

2、液-液萃取过程中需要注意的问题是，一般要求反复萃取2~3次，才能获得大于99%的回收率^[11]，在三氯甲烷挥干时，少量水相即可用甲醇先溶解残渣后再用蒸馏水定容，这样得到的溶液均一。

3、通过回收率的测定比较，液-液萃取方法作为饲草类样品的提取较为合适，结果较为准确，但是还存在处理操作复杂，处理时间长，且消耗有机溶剂体积大的问题。

4、免疫亲和层析因净化彻底而被广泛应用^[12]，但如何降低非特异性吸附来提高回收率，还需进一步研究。

参考文献

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