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免疫亲和柱回收率影响因素探讨

文章出处：admin责任编辑：苏微人气：发表时间2024/7/2 10:43:15【大中小】

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免疫亲和柱回收率受多种因素的影响，这些因素可以归纳为以下几个方面：

一、样品处理与上样条件

样品溶液的性质：

酸碱度：样品溶液应保持酸碱中性，以避免影响抗体与目标分子的结合效率。

悬浮物：样品中不应含有悬浮物，这些悬浮物可能会阻塞柱子，影响回收率。

甲醇浓度：甲醇浓度不宜过高，因为高浓度的甲醇可能会破坏抗体与目标分子的结合，降低回收率。

上样流速：

待测样液通过免疫亲和柱的流速会影响回收率。流速过快可能导致样品与抗体结合不充分，流速过慢则可能增加非特异性结合。

二、实验环境条件

温度：

抗原抗体发生反应的最佳温度通常在25℃左右，实验需要的环境温度最好是室温24℃-28℃。太高或太低的温度都会对亲和柱的回收率有一定的影响。亲和柱在使用前需要恢复至室温再进行实验。

三、免疫亲和柱自身特性

柱空白：

免疫亲和柱自身可能存在本底，即所谓的柱空白。这可能是由于柱子在制备或储存过程中引入了杂质或抗体本身的非特异性结合导致的。柱空白的存在会降低回收率。

抗体性能：

抗体的特异性、亲和力以及稳定性都会影响回收率。特异性差的抗体会导致非特异性结合增加，从而降低回收率；亲和力不足的抗体会导致目标分子与抗体的结合不牢固，也会降低回收率。

柱容量：

柱容量是指免疫亲和柱能够结合的目标分子的最大量。如果样品中的目标分子浓度过高，超过了柱子的容量，就会导致部分目标分子无法被结合，从而降低回收率。

四、净化与洗脱条件

净化条件：

免疫亲和柱净化后的液相色谱分离条件会影响回收率。不同的分离条件可能会导致目标分子与杂质分子的分离效果不同，从而影响回收率。

洗脱溶剂的量：

洗脱溶剂的量需要适中。过少可能无法将目标分子完全洗脱下来，过多则可能引入更多的杂质。一般来说，洗脱溶剂的量在柱床体积的3～5倍已足够。

洗脱后处理：

样液免疫亲和柱净化后，洗脱液过0.45um或更小孔径滤膜可以去除杂质，提高回收液的纯度，从而间接影响回收率的准确性。

五、其他因素

基质效应：

不同类型的样品基质可能会影响目标分子与抗体的结合效率，从而导致回收率的差异。因此，在实验中需要根据样品基质的类型选择合适的前处理方法。

操作规范性：

实验操作的规范性也会影响回收率。例如，洗涤次数、洗涤液的选择和浓度等都会影响非特异性结合的去除效果，从而影响回收率。

综上所述，免疫亲和柱回收率受样品处理与上样条件、实验环境条件、免疫亲和柱自身特性、净化与洗脱条件以及其他多种因素的影响。在实际操作中，需要综合考虑这些因素，并进行适当的优化和调整，以获得准确可靠的回收率结果。

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