免疫亲和柱净化-高效液相色谱法测定饲料中玉米赤霉烯酮的不确定度评定

玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）又称F-2毒素，是一种2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物，分子式为C₁₈H₂₂O₅，主要由镰刀菌属菌株（如禾谷镰刀菌F.graminearum）产生^[1]；其耐热性较强，主要污染玉米、小麦、大米、大麦、小米和燕麦等谷物^[2-3]。玉米赤霉烯酮具有类雌激素作用，以雌性动物的生殖系统为靶器官，引起雌激素水平升高，产生雌激素亢进症，使繁殖机能出现异常^[4]；此外，玉米赤霉烯酮通过直接损伤免疫系统，导致动物抵抗力下降；通过氧化损伤，引起动物肝肾组织退行性变化，造成肝肾功能紊乱；通过损伤内分泌系统，导致动物内分泌紊乱，给养殖业带来巨大经济损失^[5-6]。玉米赤霉烯酮还可通过食物链在人体中蓄积，给人类健康造成极大的危害^[7]。我国《饲料卫生标准》GB13078-2017明文规定，仔猪、母猪和其他猪的配合饲料，玉米赤霉烯酮含量分别不得超过150、100和250 μg/kg，犊牛、羔羊、泌乳期精料补充料和其他配合饲料不得超过500 μg/kg^[8]。

玉米赤霉烯酮测定方法主要有酶联免疫吸附法（ELISA）^[9]、胶体金法（GICT）^[10]、色谱串联质谱法（LC-MS/MS）^[11]和高效液相色谱法（HPLC）^[12]。免疫亲和柱净化-高效液相色谱法是一种免疫亲和净化与色谱法相结合的测定技术，通过与抗体的特异性结合，达到快速、高效、专一地从样本中分离出待测物，该方法具有较高的准确度、灵敏度和良好的选择性、重现性，特别适合于饲料等复杂样本的精准测定，因而成为玉米赤霉烯酮检测的权威方法^[13-14]，并专门制定了该方法用于饲料中检测的国家标准^[15]。然而，经检索国内文献，还未见专门针对该方法用于玉米赤霉烯酮测定的不确定度分析报告。

为了推动免疫亲和柱净化-高效液相色谱法在饲料检测领域的应用，本文依据CNAS-GL006-2019《化学分析中不确定度的评估指南》^[16]，以实验室随机抽取的饲料样品为研究对象，对国标方法GB/T 28716-2012《饲料中玉米赤霉烯酮的测定免疫亲和柱净化-高效液相色谱法》^[15]开展不确定度分析，从样品提取、净化、色谱等操作到各个分量，系统全面地进行评定与合成，发现影响实验数据的最大因素，帮助检测人员关注检测的关键环节，提高检测结果的准确性和可靠性。

1材料与方法

1.1材料

        样品来自于江苏省苏微微生物研究有限公司样品室保藏的动物饲料阳性样本（编号：sw-cp1112），为某单位送检的肉鸡后期配合饲料（按照饲料卫生标准规定，限量≤500 μg/kg）。玉米赤霉烯酮免疫亲和柱，江苏省苏微微生物有限公司生产，产品编号SWIAC501。玉米赤霉烯酮标准物质溶液GBW（E）100301，浓度20.52 μg/mL，国家粮食局科学研究院。

        甲醇、乙腈，均为HPLC级，北京百灵威科技有限公司。吐温-20、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化钾、氯化钠、氢氧化钠，均为分析纯级，国药集团上海生化试剂公司。有机滤膜（孔径0.22 μm），上海安谱实验科技股份有限公司。934-AH^TM型玻璃纤维滤纸（直径11cm、无荧光特性），Whatman公司。实验用水符合GB/T 6682-2008中一级水要求^[17]。

1.2仪器设备和计量器具

        LC-20AT型高效液相色谱仪（配有RF-20Axs荧光检测器），日本岛津公司。Sepax C₁₈色谱柱（4.6×150 mm、5 μm），美国赛芬科技公司。DFY-500型摇摆式粉碎机，温岭市林大机械有限公司。PL203型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。德国IKA/KS130型圆周式振荡器，艾卡仪器设备有限公司（IKA中国）。MX-F型振荡器，大龙兴创实验仪器（北京）股份公司。H1850型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。FE28型台式pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

        50 mL玻璃量筒（最大容量允差±0.5 mL）、100 mL玻璃量筒（最大容量允差±1.0 mL）、1000 mL玻璃量筒（最大容量允差±10.0 mL），BOMEX公司。200 μL微量移液器（最大容量允差±1.2 μL）、1000 μL微量移液器（最大容量允差±5.0 μL）、5000 μL微量移液器（最大容量允差±30 μL），Thermo公司。

1.3测定步骤

1.3.1试剂配制

        0.2 mol/L氢氧化钠溶液：称取8 g氢氧化钠，加水溶解，冷却后用水定容至1000 mL。

        样品提取液（80%乙腈-水溶液）：将800 mL乙腈与200 mL水混合均匀。

        PBS磷酸盐缓冲溶液（pH7.4）：称取8 g氯化钠、1.16 g磷酸氢二钾、0.2 g磷酸二氢钾与0.2 g氯化钾，用水溶解，并定容至1000 mL，0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.4。

        0.1%吐温-PBS：量取100 mL上述PBS磷酸盐缓冲液（pH7.4），加入100 μL 吐温-20，混合均匀。

流动相：量取460 mL乙腈至1000 mL的容量瓶中，加入460 mL水和80 mL甲醇，混合均匀并通过0.45 μm滤膜，备用。

        玉米赤霉烯酮标准中间液（2.052 μg/mL）：用微量移液器准确移取1.0 mL玉米赤霉烯酮标准物质溶液（20.52 μg/mL），置于10 mL容量瓶中，用乙腈稀释定容至刻度，混合均匀。

        玉米赤霉烯酮标准工作溶液：根据实际使用需求，用移液器分别准确吸取玉米赤霉烯酮标准中间液50 μL、125 μL、250 μL、1250 μL和2500 μL置于五个5 mL容量瓶中，用流动相稀释定容至刻度，得到20.52 ng/mL（0.02052 μg/mL）、51.30 ng/mL（0.05130 μg/mL）、102.6 ng/mL（0.1026 μg/mL）、513 ng/mL（0.513 μg/mL）、1026 ng/mL（1.026 μg/mL）共5种不同浓度的玉米赤霉烯酮标准工作溶液。玉米赤霉烯酮标准工作液储藏在2℃~8℃冰箱内，可使用6个月。

1.3.2提取方法

        将样品粉碎至全部通过40目分样筛，充分混合均匀。

        准确称取粉碎后的样品40.0 g于250 mL具塞锥形瓶中，加入4.0 g氯化钠和100 mL样品提取液，置于振荡器上振荡提取30 min。提取液全部转移至离心管中，4000 rpm离心 5 min。准确移取上清液10 mL，加入40 mL PBS磷酸盐缓冲溶液（pH7.4），振荡混合均匀。用0.2 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.0左右，经玻璃纤维滤纸过滤1~2次，即得样品制备液。

1.3.3净化方法

        根据国标^[15]中“7.2净化”的说明，本文免疫亲和柱的使用可按生产厂家——江苏省苏微微生物有限公司的说明执行：将玉米赤霉烯酮免疫亲和柱取出，平衡至室温；将20 mL注射器连接于免疫亲和柱的上堵头。用微量移液器准确移取10.0 mL样品制备液（相当于0.8 g样品），注入注射器中；将气孔架与免疫亲和柱的下堵头连接，调节压力使样液以2秒/滴速度缓慢通过柱体。由于饲料组成复杂且颜色较重，先用10 mL 0.1%吐温-PBS清洗柱子，再用10 mL 10%甲醇-水冲洗柱子，最后用10 mL水冲洗柱子（流速控制在不大于2 mL/min~3 mL/min），弃去流出液。准确加入2.0 mL甲醇（HPLC级），依靠自然重力流速洗脱柱子。收集全部洗脱液于55℃氮气吹干，用2.0 mL流动相复溶，漩涡混匀后，用有机滤膜（孔径0.22 μm）过滤。收集滤液，即为待测样液，可直接进行高效液相色谱（HPLC）测定。

1.3.4液相色谱条件

      色谱柱：Sepax C18（4.6×150 mm、5 μm），流动相：乙腈︰水︰甲醇=46︰46︰8，流速：0.8 mL/min，进样量：20 μL，柱温：30 ℃，检测波长：激发波长274 nm；发射波长440 nm。

1.4数据计算

1.4.1标准曲线制备

        由低浓度到高浓度，分别取玉米赤霉烯酮标准工作溶液20 μL，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定峰面积。重复性条件下，计算三次测定值的算数平均值；以浓度为横坐标、峰面积平均值为纵坐标，绘制标准曲线，并拟合获得标准曲线回归方程。

1.4.2样液中毒素浓度的计算

        取“1.3.3净化方法”所得待测样液20 μL，注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定峰面积。将测得的峰面积值，代入标准曲线回归方程，计算出样液中毒素浓度。

1.5数学模型

样品中玉米赤霉烯酮含量（C）的计算公式为^[15]： 

        式中：C—样品中玉米赤霉烯酮含量，μg/kg；P_i—样液的峰面积；V—样品的总稀释体积，100 mL；C_st—标准工作溶液的浓度，ng/mL；V_st—标准工作溶液的进样体积，20 μL；P_st—标准工作溶液的峰面积平均值；m—样品的称样量，40.0 g；V_i—样液的进样体积，20 μL。

1.6不确定度分量的来源

根据上述“1.3测定步骤”和“1.4数据计算”，可以看出整个测定过程包含样品称量、样品提取、样品净化、标准液配制和标准曲线制备，以及数据处理等，每一步都会引入误差。

对于实际测定，标准曲线的制备、样品提取中的萃取、样品净化中的免疫反应和洗脱反应等操作引入的不确定度是难以量化的。因此，结合实际工作可以采用标准曲线拟合、回收率校正因子、重复性等，来对这些步骤的不确定度进行评定，即指A类评定^[18]，主要有（1）标准曲线拟合引入的相对不确定度U_st-r；（2）回收率校正因子的相对不确定度U_rec-r；（3）重复性测定引入的相对不确定度U_p-r。

在实际测定中，对于称量、量取、稀释、加样、读数和数据处理等引入的不确定度，可以通过天平、量筒、微量移液器和高效液相色谱仪等的误差，以及线性相关系数来评定，属B类评定^[18]，主要有（1）标准物质纯度引入的相对不确定度U_b-r；（2）样品称量引入的相对不确定度U_m-r；（3）样品提取引入的相对不确定度U_d-r；（4）样品净化引入的相对不确定度U_e-r；（5）高效液相色谱实验操作引入的相对不确定度U_h-r；（6）数据处理引入的相对不确定度U_n-r。