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脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物免疫亲和柱的研制

文章出处:admin责任编辑:苏微人气: 发表时间2023/6/29 13:44:03【
 摘要: 本实验采用抗DON杂交瘤细胞株SW-3 F4SW-3 G12,分别制备出两种不同特性的单抗,然后与蛋白A-琼脂糖凝胶定向偶联,制备出了能同时分离净化DON3-Ac-DON15-Ac-DON的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)及其乙酰化衍生物的三合一免疫亲和柱(IAC),并对其性能进行了评价。结果表明抗体1和抗体2均为IgG1亚型,亲和常数分别为3.0×108 L/mol 2.0×109 L/mol,与DON3-Ac-DON15-Ac-DON的交叉反应率分别为100%、0.1%、453%和100%、101%、6%。制备的IAC柱,单标过柱的平均柱容量DON3-Ac-DON15-Ac-DON依次为3243 ng/0.25 mL1285 ng/0.25 mL1527 ng/0.25 mL非特异性吸附率小于2.3%,三种毒素在小麦基质中平均加标回收率均大于89%。本实验制备的IAC柱容量大、回收率高,适于DON及其乙酰化衍生物的纯化分离。

关键词:脱氧雪腐镰刀菌烯醇;衍生物;免疫亲和柱;定向偶联;性能评价

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenolDON)又称呕吐毒素,是一种单端孢霉烯族真菌毒素;其乙酰化衍生物主要有3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(3-Ac-DON)和15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇(15-Ac-DON)两种,大约占谷物中总DON量的10%左右[1]

DON及其乙酰化衍生物主要由镰刀菌属产生,理化性质稳定[2]。联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)已将DON确定为最危险的自然发生食品污染物之一[3],国际癌症研究中心(IARC)于1993年将其列为三类致癌物[4]3-Ac-DON和15-Ac-DON作为隐蔽型DON,在体内会水解为毒素单体,被认为毒性与DON相当,其污染水平在评估人类DON实际膳食暴露量时具有重要指导作用[5-6]。国标[7]和出入境检验检疫行标[8]中规定采用色谱法检测谷物及食品中的DON3-Ac-DON15-Ac-DON三项;虽然色谱法具有准确度、精密度和灵敏度高的优点,但需要强有力的样品前处理技术,以达到富集净化、降低基质噪音的目的。

免疫亲和柱(IAC)是基于抗原抗体可逆性结合为原理,将目标物从样品中分离出来,同时完成净化与浓缩,具有操作简便、特异性强、净化彻底等优点[9]。目前关于真菌毒素IAC制备,多采用单一抗体制备单一毒素IAC[10-12],仅杨婷婷等采用三种抗体制备了黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和DON多合一免疫亲和柱[13]。虽然应用DON及其乙酰化衍生物的IAC进行液相或者液质测定已有报道[14],但包括国标[7]在内,对DON及其乙酰化衍生物的IAC均未作出性能评价要求。

本文以实现DON及其乙酰化衍生物被同时净化为目的,通过制备两种不同特性的单抗、以蛋白A-琼脂糖凝胶为载体定向偶联制备大容量IAC,并对其进行性能评价,为商品化IAC评价技术规范的制定奠定基础。过程略,对免疫亲和柱使用盒免疫亲和柱相关技术研究欢迎一起探讨!

3讨论

由杂交瘤细胞株SW-3 F4SW-3 G12获得抗体1和抗体2两种特性的单抗,虽亚型相同,但对DON3-Ac-DON15-Ac-DON的交叉反应形成良好的互补,从亲和常数Ka上看都在108-109 L/mol,一般认为中等亲和力的抗体可用作亲和层析的配基,以避免强力洗脱时纯化物质的损伤。

邓舜洲研制的DON免疫亲和柱,采用CNBr活化的琼脂糖4FF 胶作为偶联载体,属随机偶联方式[21],而本文采用的是蛋白A-琼脂糖凝胶作为偶联载体,属定向偶联方式[22]。前者免疫亲和柱的柱容量为1 000 ng/0.5 mL(=2 000 ng/mL[12],本文免疫亲和柱的柱容量为3 2431 2851 527 ng/0.25 mL(=12 9725 1406 108 ng/mL),两者相差数倍。这种差异是由于随机偶联方式其靠近抗体的结合位点指向有碍与毒素结合的空间,因此抗体与毒素的结合力较差[21];而定向偶联方式使单抗的FC端始终朝向蛋白A,另两个分叉部位则一致朝外,充分暴露在与毒素结合的方向,因此有效提高了抗体与毒素的结合容量[23]

本文采用抗体1和抗体2制备的三合一IAC有一定量的柱空白,但在凝胶载体、交联剂及缓冲溶液中并未发现含有DON,推测此柱空白可能来自于抗体中的DON。因为研究人员发现[24-25]DON经小鼠代谢在血浆、组织中都有广泛分布,且正常的小鼠经24小时基本排出体外。经检测,饲喂的鼠粮中DON平均含量在0.8-1.0 mg/kg,因单抗的制备采用的是小鼠腹腔注射细胞分泌形成,推测游离DON通过血管、肠道等途径进入腹腔与抗体形成复合物,并逐渐累积。是否可以通过饲喂含一定量毒素脱霉剂,来减少DON暴露量,进而消除抗原抗体结合物的累积,还需进一步的研究。

国际食品添加剂联合专家委员会(JECFA)于2010年确定DON及其乙酰衍生物总和的每日容许最大摄入量为1.0 μg/kg/d,欧盟正在考虑将目前执行的单一DON限量标准修订为DON及其衍生物(包括隐蔽型)之和[26]。因此跟踪国际新标准,将我国现行食品中针对DON单一限量修订为DON及其衍生物之和为大势所趋。本文及时顺应该趋势,研制出了DON3-Ac-DON15-Ac-DON三合一免疫亲和柱,并评价了其性能,为现行的两大测定呕吐毒素及其乙酰化衍生物国家标准[7-8]提供了强有力的样品前处理手段,这对提升我国的真菌毒素检测水平,具有一定的促进意义。

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